定点突变

定点突变技术是一种通过精确修改DNA序列来引入预期变化的分子生物学方法，这些变化可以是特定碱基的增添、缺失或替换。此技术广泛应用于基因组DNA或质粒DNA，旨在通过引入有利于特定性状的变异来探索或优化生物功能。

单点突变的原理简述

单点突变操作从提取质粒开始，通常使用Miniprep试剂盒或氯化铯方法从大肠杆菌中纯化质粒。接着，设计一对特异性引物，确保它们包含所需突变位点，分别对应正向和反向链。这些引物与模板质粒退火后，采用高保真PfuTurbo聚合酶进行“循环延伸”——这一步骤涉及聚合酶根据模板指导引物延伸，每轮循环后回到引物的5'端停止，随后再次加热促使引物复配，如此往复，但不同于滚环扩增，不会生成串联重复序列。延伸产物配对形成缺口的开放环结构。随后使用DpnI酶处理，由于野生型质粒在大肠杆菌中经历了dam甲基化（特别是在GATC序列上），DpnI能特异性切割这些甲基化的DNA，而体外合成的未甲基化、带有突变的质粒则免受切割，从而在细菌转化后能够成功克隆。

多点突变的原理概览

多点突变策略涉及使用多对针对同一链模板的突变引物。这些引物在退火后，每个都能与模板结合，PfuTurbo聚合酶沿着模板延伸，直到遇到下一个引物结合处停止。随后，这些片段通过连接反应形成闭环，与单链模板共同构成杂合环。DpnI消化作用于双链模板及杂合环中的模板链，保留下来的是仅含有多重突变的单链DNA环，再通过转化大肠杆菌转化为双链质粒。据报道，引入三个突变的成功率约为60%，五个突变则降低到30%左右，其余转化可能包含少于预期突变的质粒，反映了一定程度的非特异性结合与延伸。

定点突变的应用领域

• 蛋白质功能解析：通过改变蛋白质的相互作用界面，研究其结构与功能关系，优化酶的活性和动力学特性。

• 基因调控元件调整：改造启动子序列或DNA调控元件，以研究其对基因表达的影响。

• 蛋白质工程：提升蛋白质的稳定性和抗原性，用于结构生物学研究，或开发更有效的药物和基因治疗策略。 综上所述，定点突变技术是现代生物科学研究中不可或缺的工具，它不仅深化了我们对基因功能的理解，也为遗传改良和疾病治疗提供了有力手段。